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本制品是从表达T4 DNA Ligase基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化而来的，催化相邻DNA链的5’磷酸基团和3’羟基基团以磷酸二酯键结合反应。该酶可催化平末端或粘性末端DNA之间的连接，还可修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交双链中的单链切口。本制品可应用于DNA插入片段和载体DNA的粘性末端和平末端的连接，以及线性DNA的自身环化。

• T4 DNA Ligase的最终用量不要超过推荐的用量，否则影响连接效率。
  
• PEG可以极大提高平末端的连接效率，我们推荐加入终浓度为5% PEG Solution以提高平末端的连接效率。
  
• 为了提高转化效率，建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。
  
• 由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深以免粘在枪头上造成损失。

• 粘性末端的连接：
  
  • 按以下体系配制反应液：
    

    成分	用量	终浓度
    线性载体DNA	X μL	20～100ng
    插入DNA片段	Y μL	插入片段：载体1:1～5:1
    10×Ligation Buffer	2μL
    T4 DNA Ligase(5U/μL)	0.2μL	1U
    ddH2O	至20μL

  • 涡旋震荡，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
    
  • 反应条件：22℃孵育10分钟。
    
  • 瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
    
  • 可取5μL连接产物热击转化50μL感受态细胞或取1～2μL连接产物电击转化50μL感受态细胞。
    注意：如需电击转化，推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。
• 平末端的连接：
  
  • 反应体系：
    

    成分	用量	终浓度
    线性载体DNA	X μL	20～100ng
    插入DNA片段	Y μL	插入片段：载体1:1～5:1
    10×Ligation Buffer	2μL	-
    T4 DNA Ligase(5U/μL)	1μL	5U
    50% PEG Solution	2μL	5%
    ddH2O	至20μL	-

  • 涡旋震荡，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
    
  • 反应条件：22℃孵育1小时。
    
  • 瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
    
  • 可取5μL连接产物热击转化50μL感受态细胞或取1～2μL连接产物电击转化50μL感受态细胞。
    注意：如需电击转化，推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。
• 线性DNA的自身环化：
  
  • 反应体系：
    

    成分	用量	终浓度
    线性载体DNA	X μL	5～50ng
    10×Ligation Buffer	5μL	-
    T4 DNA Ligase(5U/μL)	1μL	5U
    ddH2O	至50μL	-

  • 涡旋震荡，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。
    
  • 反应条件：粘性末端22℃孵育10分钟；平末端22℃孵育1小时。
    
  • 瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底，65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase。
    
  • 可取5μL连接产物热击转化50μL感受态细胞或取1～2μL连接产物电击转化50μL感受态细胞。
    注意：如需电击转化，推荐用乙醇沉淀法去除T4 DNA Ligase后进行电击转化。